摘要GalNAc偶联被广泛用于肝细胞靶向核酸药物递送但“靶向”并不意味着在任何剂量、任何时间和任何肝脏细胞环境中都必然具有更高总体摄取。GSK相关研究利用CN Bio PhysioMimix建立由原代人肝细胞和Kupffer细胞组成的3D灌流肝脏模型对非靶向ASO和GalNAc-ASO进行时间、浓度和细胞类型层面的摄取比较。结果显示在2 μM、1小时条件下GalNAc-ASO具有较高摄取而随着时间延长或浓度提升两类ASO呈现不同摄取动力学。结合多光子、SRS、SLAM及Light-sheet等成像技术研究进一步将药物分布从整个芯片平均水平细化到具体肝细胞和亚细胞空间。本文重点解析这项研究对GalNAc递送、ASO靶向评价和复杂体外模型设计的启示。关键词GalNAc-ASO、ASO、反义寡核苷酸、GalNAc递送、肝脏器官芯片、PhysioMimix、原代人肝细胞、Kupffer细胞、核酸药物、细胞摄取、药物分布一、“靶向递送”最容易让人产生一个过度简化的理解在核酸药物开发中当一种递送修饰能够提高目标细胞摄取时研究人员很自然会将其理解为“加入这个靶向基团后药物递送效率就会整体提高”。GalNAc与肝细胞相关受体途径之间的关系使其成为肝脏靶向核酸药物的重要递送策略但真实组织环境中的药物分布远比单一受体-配体关系复杂。肝脏中不仅存在肝细胞还包括Kupffer细胞、肝窦内皮细胞及其他细胞群体。同一份药物进入肝脏之后这些细胞会共同参与药物摄取。因此提高肝细胞摄取并不一定意味着整个组织中所有与药物作用相关的细胞都能够获得更多药物。GSK相关研究正是针对这个问题进行深入分析并使用CN Bio PhysioMimix肝脏器官芯片构建更加复杂的人源肝脏模型。二、单一肝细胞实验为什么可能高估“靶向优势”如果实验体系只有肝细胞那么GalNAc相关摄取优势很容易直接体现在细胞内药物信号中因为模型中不存在其他细胞群体与肝细胞竞争药物。在真实组织中情况却不同非靶向ASO可能被其他肝脏细胞大量摄取而GalNAc-ASO则更倾向肝细胞因此两种药物在组织尺度上的总体分布模式会发生重新分配。图1普通PS-ASO与GalNAc-PS-ASO在巨噬细胞和原代肝细胞中的摄取动力学这种分布差异意味着只利用一种细胞得出的“摄取效率”不能完整代表肝脏组织中真实发生的情况。核酸药物研发越来越需要把肝细胞和非实质细胞放入同一个体系研究它们同时面对药物时产生的竞争性摄取。三、3D肝脏模型如何增加细胞分布这一维度相关研究采用原代人肝细胞和Kupffer细胞建立3D共培养体系细胞比例为10:1并在多孔支架环境中进行培养。相较传统二维单细胞培养该模型允许两类细胞同时存在于三维组织环境中使实验能够比较药物在不同细胞群体之间如何重新分布。图2CN Bio 3D肝脏模型用于研究ASO在不同肝脏细胞之间的摄取和分布加入灌流之后培养液持续通过细胞组织使药物暴露也变成一个动态过程。因此研究人员看到的不再只是培养皿中细胞直接浸泡于固定浓度药物中的结果而是更加接近组织环境中的持续运输和摄取。四、2 μM、1小时GalNAc-ASO为什么首先显示明显优势在2 μM条件下暴露1小时后研究观察到GalNAc-ASO总体细胞摄取高于非靶向ASO。这一现象符合GalNAc促进肝细胞靶向摄取的设计逻辑也说明在相对早期暴露阶段受体介导摄取能够快速提高药物进入相应细胞的效率。如果实验只在这一时间点结束结论很容易被概括成“GalNAc-ASO摄取明显优于非靶向ASO”。但研究继续延长时间以后结果开始发生变化而这正是复杂模型真正有价值的部分。五、4小时以后为什么非靶向ASO总体摄取反而超过GalNAc-ASO当暴露时间延长至4小时非靶向ASO的整体摄取超过GalNAc-ASO。这说明两种药物进入细胞的速度曲线并不相同。GalNAc相关途径可能在早期迅速提高特定细胞摄取但非靶向ASO通过其他路径持续进入不同细胞之后整体组织中的累计信号可能逐渐增加。这一结果说明药物递送不能脱离时间讨论。“1小时谁更高”和“4小时谁更高”本质上是两个不同问题。对于需要长期细胞暴露的药物早期进入速度和最终累计摄取量都可能影响药效因此完整的时间动力学比单个时间点更有解释力。六、剂量提高以后GalNAc优势为什么进一步发生变化研究进一步比较2 μM、10 μM和50 μM等条件。在2 μM早期时间点GalNAc-ASO表现出较高摄取而在更高浓度下非靶向ASO总体细胞摄取反而更高。图3GalNAc-ASO与非靶向ASO摄取表现随时间和剂量发生变化研究者将这一现象与GalNAc-ASGPR相关摄取途径可能出现受体饱和联系起来。当药物浓度越来越高时受体介导路径本身的处理容量并不是无限的因此简单增加剂量不能保证靶向递送优势无限扩大。这一结果对于其他受体靶向递送策略同样具有启发意义靶向配体是否有效不能只通过“有无配体”进行二元比较还需要研究受体表达量、剂量范围、时间过程和其他摄取途径。七、总体摄取更高并不代表目标肝细胞摄取一定更高当整个芯片的平均信号显示非靶向ASO在4小时或高浓度条件下总体更高时还存在另一个关键问题这些额外药物究竟进入了哪些细胞研究进一步分析了具有特定形态的立方形肝细胞并发现1小时后GalNAc-ASO在这类肝细胞中的摄取仍然明显高于非靶向ASO。图4从芯片整体尺度进一步分析至特定肝细胞的ASO摄取和空间分布这说明“整个组织平均摄取”和“目标细胞摄取”不能被当作同一个指标。非靶向ASO总体信号更高可能来自多个细胞类型共同摄取而GalNAc-ASO则可能更集中地进入特定肝细胞。对于真正的靶向药物而言后一个问题往往比整体组织浓度更加关键。八、为什么还需要看到ASO在细胞里面的位置即使确认ASO已经进入目标细胞研究仍然没有结束因为核酸药物最终需要到达能够实现分子作用的位置。药物如果主要停留在不适合的细胞内区域也可能影响实际生物活性。研究中的高分辨成像显示ASO信号呈现特定的细胞内空间分布而不是均匀充满整个细胞。这使研究人员能够进一步研究药物摄取之后的细胞内运输过程。因此核酸药物递送问题实际上可以被拆成多个连续步骤组织到达、细胞类型选择、细胞摄取以及亚细胞转运。器官芯片与高级成像结合的意义就是让这些原本难以同时观察的步骤逐渐进入同一个实验框架。九、多模态成像为什么特别适合器官芯片复杂3D模型本身会增加成像难度因此研究使用多光子显微镜、SRS、SLAM和Light-sheet等多种光学技术进行互补分析。这些方法既能够观察荧光标记ASO也可以在无标记条件下获取细胞和组织化学信息。图5多模态光学成像用于分析3D肝脏模型中的药物分布与细胞组织结构原稿资料中SLAM能够观察约150 μm深度组织而Light-sheet进一步实现约250 μm尺度的3D可视化。这种深层三维成像对于普通二维培养没有太大必要但对于具有真实厚度的器官芯片组织则成为重要分析手段。十、这项研究真正告诉我们的不是“GalNAc好还是不好”如果把实验结果简单概括成“GalNAc在低剂量好、非靶向ASO在高剂量好”反而会丢失最重要的信息。研究真正说明的是递送策略的表现依赖时间、浓度、细胞类型以及评价尺度。同一个GalNAc-ASO在整个芯片平均值、特定肝细胞、1小时、4小时、2 μM和50 μM条件下可以呈现完全不同的相对表现。因此“靶向递送效率”不应该被定义为一个单一数字而更像是一张多维响应图。这也正是复杂人源体外模型能够补充二维实验的地方它把原本被平均掉的细胞异质性和空间信息重新带入药物研发。十一、Bepirovirsen热点为什么与这项研究具有技术关联Bepirovirsen是非GalNAc ASO而其研发历史中也存在GalNAc偶联版本及相关细胞分布问题因此此次获批使“核酸药物应该进入哪些肝脏细胞”这一研发问题再次具有很强现实意义。需要注意的是本文讨论的PhysioMimix研究本身主要用于理解非靶向ASO与GalNAc-ASO的摄取和分布机制并不能直接解释为器官芯片参与了Bepirovirsen最终审批。更准确的理解是从一款ASO药物的研发和获批可以进一步看到核酸递送研究为何越来越需要人体相关、多细胞和3D模型。图6CN Bio PhysioMimix器官芯片相关应用示意图十二、总结GalNAc是一种重要的肝细胞靶向递送策略但复杂肝脏模型研究表明靶向效果需要放在剂量、时间和具体细胞类型中理解。一个早期时间点得到的高摄取结果不一定能够代表更长时间的组织累计分布整个模型平均信号更高也不意味着目标肝细胞一定获得更多药物。PhysioMimix等多细胞灌流肝脏模型与多模态成像结合之后可以将核酸药物研究从简单的“进入/不进入”推进到“进入多快、进入多少、进入谁以及进入哪里”。对于ASO、siRNA和其他肝脏靶向核酸药物这类多维数据能够为递送机制研究、候选分子比较和剂量设计提供更加接近人体肝脏微环境的实验参考。参考文献Majer J, Alex A, Shi J, et al. Multimodal imaging of a liver-on-a-chip model using labelled and label-free optical microscopy techniques.Lab on a Chip. 2024;24(19):4594–4608. DOI:10.1039/D4LC00504J.拓展阅读CN Bio PhysioMimix肝脏器官芯片技术资料参考关于技术来源本文基于GSK及CN Bio公开ASO、GalNAc递送和肝脏器官芯片研究信息曼博生物整理用于科研信息分享、实验参考和核酸药物靶向递送机制理解。文中2 μM、10 μM、50 μM、1小时、4小时以及PHH/Kupffer细胞10:1等条件均来自对应公开研究体系不代表其他ASO、siRNA或GalNAc偶联分子会获得完全相同结果。相关模型主要用于研究ASO摄取与空间分布不应直接等同于任何具体药物的监管验证流程。本文围绕GalNAc-ASO、CN Bio PhysioMimix、肝脏器官芯片、ASO递送、Kupffer细胞、原代人肝细胞、细胞摄取、剂量-时间关系和核酸药物研发等方向整理相关公开技术信息。